Electroforesis Horizontal

Aquí tienes una entrada de blog sobre las mejores prácticas en electroforesis horizontal:

Blog: Las Claves del Éxito en Electroforesis Horizontal: Buenas Prácticas para Resultados Confiables

La electroforesis horizontal en gel de agarosa es una técnica fundamental en cualquier laboratorio de biología molecular. Es la herramienta de referencia para separar, identificar y cuantificar fragmentos de ADN o ARN basándose en su tamaño. Aunque parece sencilla, obtener resultados claros, reproducibles y publicables requiere atención a los detalles y la adhesión a buenas prácticas.

Si alguna vez has lidiado con bandas borrosas, geles desiguales o resultados inconsistentes, este blog es para ti. Aquí te comparto las prácticas adecuadas que marcan la diferencia.

1. Preparación del Gel: La Base de Todo

El gel es el medio a través del cual migrarán tus ácidos nucleicos, así que su preparación es crítica.

• Pesar con Precisión la Agarosa: Usa una balanza analítica para pesar la cantidad exacta de agarosa. Pequeñas variaciones pueden alterar la porosidad del gel y, por ende, la migración.

• Buffer Correcto y Concentración Adecuada: Utiliza el buffer de electroforesis apropiado (TBE o TAE son los más comunes) y asegúrate de que su concentración sea la correcta. El buffer no solo disuelve la agarosa, sino que también conduce la corriente.

• Calentamiento Homogéneo: Calienta la mezcla de agarosa y buffer en el microondas o baño maría hasta que la agarosa se disuelva completamente y la solución esté transparente, sin grumos. Remueve ocasionalmente para asegurar una disolución uniforme. ¡Cuidado con la ebullición excesiva!

• Enfriamiento Antes de Añadir el Agente Intercalante: Deja que la solución de agarosa se enfríe a unos 50-60°C antes de añadir tu agente intercalante (como bromuro de etidio o SafeGreen). Temperaturas muy altas degradarán el agente y reducirán su eficacia.

• Verter el Gel con Cuidado: Vierte el gel lentamente para evitar burbujas. Coloca el peine de forma recta y asegúrate de que no haya burbujas debajo de los dientes, ya que esto deformaría los pozos.

• Polimerización Completa: Deja que el gel solidifique completamente a temperatura ambiente (o en frío si el protocolo lo indica). Un gel no completamente polimerizado será débil y se romperá fácilmente.

2. El Buffer de Corrida: Tu Conductor Eléctrico

El buffer en la cuba de electroforesis es tan importante como el del gel.

• Mismo Buffer y Concentración: Usa el mismo tipo y concentración de buffer que utilizaste para preparar el gel.

• Volumen Adecuado: Asegúrate de que el nivel del buffer en la cuba cubra uniformemente el gel, pero sin excederse. Demasiado buffer puede causar cortocircuitos o una migración desigual.

• Reemplazo Regular: El buffer se agota y se calienta con el uso. Reemplázalo regularmente (cada 1-3 corridas, dependiendo del voltaje y tiempo) para mantener un pH y una conductividad constantes, lo que es vital para una migración consistente y para evitar el sobrecalentamiento del gel.

3. Preparación de las Muestras y Carga del Gel

Este paso requiere precisión para obtener bandas bien definidas.

• Buffer de Carga (Loading Dye): Mezcla tus muestras de ADN/ARN con el buffer de carga. Este buffer tiene dos funciones:

  • Densidad: Contiene glicerol o ficoll para que la muestra se asiente en el fondo del pozo y no flote.

  • Colorantes de Rastreo: Incluye colorantes (como azul de bromofenol o xileno cianol) que migran a velocidades conocidas, permitiéndote monitorear el progreso de la electroforesis sin necesidad de ver el ADN.

• Carga Cuidadosa: Carga las muestras lenta y cuidadosamente en los pozos usando una micropipeta. Evita perforar el fondo del pozo o introducir burbujas de aire, ya que esto puede distorsionar las bandas.

• Marcador de Peso Molecular: Siempre incluye un marcador de peso molecular (ladder) en uno o más pozos. Esto es esencial para estimar el tamaño de tus fragmentos de ADN y para verificar que la corrida se llevó a cabo correctamente.

4. Condiciones de Corrida: Voltaje y Tiempo

Ajustar el voltaje y el tiempo es clave para una buena separación.

• Voltaje Constante: La mayoría de las corridas se realizan a voltaje constante (por ejemplo, 5 V/cm, donde cm es la distancia entre los electrodos).

  • Voltaje Alto: Acelera la corrida, pero genera más calor, lo que puede causar "sonrisas" (bandas curvadas) si el gel se sobrecalienta, y puede reducir la resolución.

  • Voltaje Bajo: Ofrece una mayor resolución y menos calor, pero la corrida es más lenta.

• Monitorear el Avance: Observa el progreso de los colorantes de rastreo. Detén la corrida cuando los colorantes hayan migrado una distancia adecuada para separar tus bandas de interés.

5. Visualización: Revelando tus Bandas

El paso final para ver tus resultados.

• Seguridad con Agentes Intercalantes: Si usas bromuro de etidio, recuerda que es un mutágeno potente. Usa siempre guantes y gafas de seguridad, y manéjalo en un área designada con superficies descontaminables.

• Tiempo de Exposición: En el transiluminador UV, ajusta el tiempo de exposición para obtener una imagen clara sin saturar las bandas, lo que podría dificultar la cuantificación.

• Documentación: Toma una foto de alta calidad del gel. Asegúrate de que el gel esté bien posicionado y la iluminación sea uniforme.

Consejos Adicionales para Evitar Problemas Comunes:

• Limpieza: Asegúrate de que la bandeja del gel, los peines y la cuba de electroforesis estén siempre limpios y libres de residuos de agarosa o sales.

• Evitar Sobrecarga de Muestra: Cargar demasiado ADN en un pozo puede causar bandas borrosas o "smearing".

• Almacenamiento del Buffer: Guarda el buffer de corrida a temperatura ambiente para evitar la precipitación de sales, especialmente si usas TBE 10X.

Siguiendo estas buenas prácticas, mejorarás significativamente la calidad de tus resultados en electroforesis horizontal, lo que te permitirá avanzar con mayor confianza en tus investigaciones y experimentos. ¡La precisión en los detalles es la clave del éxito en el laboratorio!